中国预防兽医学报发布株鸽源新城疫病毒的研究成果

       鸽新城疫（Piｇｅｏｎ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）又称鸽Ⅰ型副粘病毒（Ｐｉ ｇｅｏｎ　ＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓⅠ，ＰＰＭＶ－Ⅰ） 病，是一种由ＰＰＭＶ－Ⅰ引起的一种高度接触性传染 病，目前该病毒被归为基因ＶＩｂ亚型，其基因组为 单股负链 ＲＮＡ，而基因 ＶＩｂ亚型可分为 ＶＩｂ１和 ＶＩｂ２两个分支，其中 ＶＩｂ１中毒株又可分为欧洲早期（ＥＵ／ｅｒ）、欧洲近期（ＥＵ／ｅａ）、北美（ＮＡ）和伊拉 克（ＩＱ） ４个亚分支［ １］。

       虽然ＰＰＭＶ－１仅有１个血清 型，但是不同毒株间毒力差异很大［ ２］。该病于２０世 纪７０年代末首发于中东地区，并于１９８５年传入我 国香港，同年８月珠海拱北动物检疫局从台湾引进 种鸽中检出ＰＰＭＶ －Ⅰ ［ ３］。随着经济的发展，我国的 信鸽、肉鸽以及观赏鸽的养殖规模迅速扩大，导致了ＰＰＭＶ-Ⅰ病的流行，成为威胁养鸽业的一个重要疫 病。目前我国分离到的鸽源ＮＤＶ大部分为 ＶＩｂ亚 型，该型病毒具有明显的宿主亲嗜性；而融合蛋白 （ Ｆ）是 ＮＤＶ重要的毒力因子，是 ＮＤＶ 分子生物学 研究的重点［ ４ －６］，本研究对在鸽群中分离到的７株鸽源 ＮＤＶ的部分生物学特性进行测 定，并基于 Ｆ基因序列对其进行遗传进化分析，以 期为鸽 ＮＤ的防制提供理论依据。

１　材料与方法 

     １.１　鸡胚、阳性血清、试剂　ＲＮＡ提取试剂盒购自 原平皓公司，ＮＤ标准阳性血清，Ｈ５、Ｈ９亚型禽流 感标准阳性血清由扬州大学传染病实验室制备。 ＡＭＶ 反转录酶、ＲＮＡ 酶抑制剂、Ｔａｑ 酶均购自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ＤＮＡ 胶回收试剂盒购自 Ａｘｙｇｅｎ 公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司 合成。 

     １.２　病毒的分离鉴定　无菌采集发病鸽的脾、脑、 肺、胰腺等组织，后向无菌采集的病料加入１ｍＬ四 抗ＰＢＳ，使用高速匀浆机匀浆，组织悬液反复冻融３ 次后， ８０００ｒ ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，取组织上清接种 １０日龄ＳＰＦ鸡胚，０.２ｍＬ／胚。接种后定时照胚， 弃去２４ｈ以内死胚，收集２４ｈ以后的死胚，置于 ４℃冰箱充分冷却收尿囊液，测 ＨＡ效价，无效价者 继续盲传３代。 收获尿囊液后，测得其 ＨＡ 效价，若有 ＨＡ 效 价，则使用 ＮＤＶ 及 Ｈ５、Ｈ９阳性血清进行 ＨＩ试 验。ＨＡ及 ＨＩ试验按照 ＯＩＥ推荐方法进行。病毒 纯化使用次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）以空斑法纯化 病毒，连续纯化３代后，挑蚀斑接种１０日龄ＳＰＦ鸡 胚，收集２４ｈ后的死胚，测得 ＨＡ效价为阳性者，收 取尿囊液，置－７０℃保存。 

      １.３　病毒ＲＮＡ提取及反转录　参照原平皓生物公 司ＥＡＳＹｓｐｉｎ组织／细胞 ＲＮＡ 快速提取试剂盒的 说明书提取７株 ＮＤＶ 的 ＲＮＡ。反转录体系为：３３ μＬ洗脱液与３μＬ　 ６碱基引物置７０℃水浴反应１０ｍｉｎ；后再加入１０μＬＲＴ　ｂｕｆｆｅｒ、 ２μＬ　ｄＮＴＰｓ、 １μＬ ＡＭＶ反转录酶、 １μＬ　ＲＲＩ，置４２℃水浴反应２．５ｈ。 

       １.４　ＲＴ-ＰＣＲ 反应 　 根据 ＧｅｎＢａｎｋ 上公布的 ＮＤＶ各基因型的Ｆ基因序列设计Ｆ片段的通用引 物，扩增包含Ｆ基因完整 ＯＲＦ的片段，引物序列如 下：Ｆ１：５′ －ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴ ＧＧＡＴ－３′ ；Ｆ２：５′ －ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＴＣＣ　ＡＴＴ ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＧＴＴＧ－５′。其中 ＰＣＲ反应参数为：１０ ×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ　０．５μＬ，上、下游引物 各０．５μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ，模板３μＬ，加ＳＷ 至２５ μＬ。循环参数：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ， ５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共２５个循环；最后 ７２℃充分延伸１０ｍｉｎ。 １．５　ＰＣＲ产物回收和测序　ＰＣＲ反应产物在１％ 琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳完成后胶回收，按照 Ａｘｙｇｅｎ凝胶回收试剂盒说明回收ＰＣＲ产物，回收 产物全部送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。 

       １.６　病毒Ｆ基因片段的序列分析　测序后以基因 分析软件ＤＮＡＳｔａｒ和 ＭＥＧＡ　 ５分析测序结果，将 这７株所测定的分离株的 Ｆ 基因序列与其他在 ＧｅｎＢａｎｋ上已有的部分 ＮＤＶ代表株的Ｆ基因片段 作序列比较，分析Ｆ基因的同源性，并根据 Ｆ基因 ４７～４２０位核苷酸绘制系统发育进化树。 

２　结果 

       ２.１　病毒的分离鉴定　经尿囊腔接种病料上清的 第一代ＳＰＦ鸡胚均不死亡，且无 ＨＡ 效价，盲传１ 代后７株分离毒均有 ＨＡ 效价。分离毒株均可被 ＮＤ阳性血清所抑制，而不能被 Ｈ５、Ｈ９亚型禽流感 病毒阳性血清抑制。７株分离株部分生物学特性 （表１）。

      ２.２　Ｆ基因的扩增及序列测定与遗传进化分析　 用ＮＤＶ通用引物扩增Ｆ基因片段，可获得１　７００ｂｐ 左右的条带，使用 ＭｅａＡｌｉ ｇｎ软件比较７株分离株Ｆ 基因的同源性，可以发现，本研究中７株分离毒同源 性较高，江苏、浙江、山东分离株的核苷酸序列同源 性在９７．５％～９９．５％之间；而７株分离株与我国广 泛使用的疫苗株Ｌａｓｏｔａ相比，核苷酸序列的同源性 为８３.９％～８４.７％（表２）。

基于Ｆ基因４７～４２０位的遗传进化分析（图１） 表明本研究中的７株ＮＤＶ均属ＶＩｂ亚型，国内外的 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 可分为 ＶＩｂ１、ＶＩｂ２两个分支，本研 究中的７株 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 均处 ＶＩｂ１的 ＥＵ／ｒｅ这 一分支［ １］，但是７株ＶＩｂ亚型ＮＤＶ与我国目前广泛 使用的疫苗株Ｌａｓｏｔａ遗传距离较远。 

      2.３　Ｆ蛋白氨基酸位点分析　测序结果表明，所扩 增的５株分离株的 ＯＲＦ长度均为１　６６２ｂｐ，编码５３３个氨基酸。使用Ｌａｓｅｒ ｇｅｎｅ中的 ＭｅａＡｌｉ ｇｎ软件 对本次的７株分离株进行分析，结果表明， ７株病毒 在Ｆ蛋白均含有１３个保守的Ｃ残基； Ｆ蛋白一级结 构中含有５个潜在的糖基化位点，分别位于膜外区 的８５、１９１、３６６、４４７、４７１位氨基酸和膜内区的５４１ 位氨基酸。另外， ７株病毒Ｆ蛋白的第１３２、２５９、３８０ 位氨基酸分别为 Ｓ、Ｈ、Ｎ，有别于其他基因型的ＮＤＶ，与文献［ ７］报道一致。 ７株病毒的Ｆ蛋白裂解位点氨基酸序列均为１１２ ＲＲＱＫＲＦ１１７，是典型的 ＮＤＶ 强毒株Ｆ蛋白裂解位 点的氨基酸组成，但是７株分离株的 ＭＤＴ从５０～ ９６ｈ不等，ＩＣＰＩ从０．９８～１．５１不等，说明其毒力并 不一致，因此Ｆ蛋白裂解位点序列并不是ＮＤＶ毒力 的唯一决定因素。

３　讨论 

      遗传进化分析结果表明，本研究中的７株 ＮＤＶ 病毒均属 ＶＩｂ亚型。核苷酸和氨基酸序列同源性分 析表明， ７株分离株之间同源性较高，推测这７株病 毒具有共同起源。但７株分离株与目前广泛使用的 疫苗株Ｌａｓｏｔａ遗传距离较远，这也许是免疫鸽群发生感染的原因之一。 

     ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ又可被分为两个分支，即 ＶＩｂ１、 ＶＩｂ２，本研究的中７株 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 均处于 ＶＩｂ１ 中的ＥＵ／ｒｅ这一分支，说明这几株 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 与欧洲型毒株有着比较近的遗传关系。符子华［ ８］等 从新疆分离到的３株 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 同样与Ｉｔａｌ ｙ／ １１６６／００、９９１０６（Ｆｒａｎｃｅ）最接近，认为新疆鸽源ＮＤＶ流行株与欧洲型毒株有着共同的起源，综合已有报道可以发现近些年的鸽源 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ分离株中 ＥＵ／ｒｅ这一分支的毒株占主要优势。而刘华雷等［ ９］ 报道的 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 分离株 ＮＣ９７０１、ＹＺ９７１２、 ＰＢ９６０、黎俊君等［１０］报道的２株广东分离株 ＮＤＶ／ ＧＤ-１与ＮＤＶ／ＧＤ-３均处于ＶＩｂ１的ＮＡ分支，年代 最近的 ＮＡ分支国内分离株为２００９年于安徽分离 到的Ｐ／Ａｎｈｕｉ１／０９，因此ＮＡ分支的ＶＩｂ亚型ＮＤＶ 在我国依然存在。 基因 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ的Ｆ蛋白裂解位点的氨基 酸序列呈现多样性，我国 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 分离株 Ｆ 蛋白裂解位点序列有１１２　ＲＲＱＫＲＦ１１７、 １１２　ＲＲＱＫＲＦ１１７ 和１１２　ＫＲＱＫＲＦ１１７３种，本研究中７株 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 的Ｆ蛋白裂解位点均为１１２　ＲＲＱＫＲＦ１１７，呈典型的强 毒特征。虽然本研究中７株分离株裂解位点均呈现 强毒特点，但ＩＣＰＩ值差异较大，说明其毒力由多种 因素共同决定，这与Ｄｏｒｔｍａｎｓ等［１１］观点一致。

        研究表明 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ具有明显的宿主亲嗜 性，尤其对雏鸽危害很大，成年鸽感染后排毒可达２ 周；ＳＰＦ鸡攻毒后，虽然并不能使ＳＰＦ鸡出现临床 症状，但是也可检测到排毒［12］。Ｄｏｒｔｍａｎｓ等［13］发 现将ＰＰＭＶ-１在鸡体内多次传代后ＩＣＰＩ由0.44升 至0.90，因此 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ必须引起我们的重视， 鸽群与鸡群需严格隔离饲养。 

        国内的 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 病毒来源并不一致，既 有欧洲型又有美洲型，并且也并没有因为地理位置 的不同而表现出明显的差异，推测这与候鸟迁徙、信 鸽比赛以及引种等有关。目前 ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ仍然 为鸽群中 ＮＤ的优势流行株，并且存在对鸡毒力增 强的潜在风险，需提高警惕。此外，ＶＩｂ亚型 ＮＤＶ 与广泛使用的疫苗株Ｌａｓｏｔａ同源性不高，并且现有 的血清学研究表明Ｌａ　Ｓｏｔａ血清不能有效中和 ＶＩｂ 亚型 ＮＤＶ［ ７，１４］，因此需研制和推广针对信鸽ＶＩｂ亚型巴拉米哥（ ＮＤＶ） 感 染的新型疫苗。

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参考文献：

［ １］　ＵＪＶＡ′ＲＩ　Ｄ，ＷＥＨＭＡＮＮ　Ｅ，ＫＡＬＥＴＡ　Ｅ　Ｆ，ｅｔ 　ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ 　ａｎａｌ ｙ ｓｉｓ 　ｒｅｖｅａｌｓ 　ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ 　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ

ａｖｉａｎｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ 　 ｔ ｙｐｅ 　 １ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ 　 ｐ ｉ ｇｅｏｎｓ（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ）ａｎｄ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｍｕｌｔｉ ｐ ｌｅ 　 ｓｐｅｃｉｅｓ 　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ［ Ｊ］． Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ，２００３，９６（ １ －２）：６４ －７４．

［ ２］　ＡＬＥＸＡＮＤＥＲ　 Ｄ　 Ｊ，ＲＵＳＳＥＬＬ　 Ｐ　 Ｈ，ＰＡＲＳＯＮＳ　 Ｇ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉ ｇｅｎｉｃ 　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ａｖｉａｎｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ 　 ｔ ｙｐｅ 　 Ｉ 　 ｉｓｏｌａｔｅ 　 ｆｒｏｍ　 ｐ ｉ ｇｅｏｎ －Ａｎ 　 ｉｎｔｅｒｎａ－ｔｉｏｎａｌ 　 ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ 　ｓｔｕｄｙ［ Ｊ］．Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ，１９８５，１４ （ ３）：３６５ －３７６．

［ ３］　李德厚，刘文灿，陈　琨，等．从进口种鸽多次检出鸽新 城疫病［ Ｊ］．中国兽医杂志，１９８８，１４（ ６）：５４ －５５． 

［ ４］　ＤＯＲＴＭＡＮＳ　 Ｊ　 Ｃ，ＫＯＣＨ　 Ｇ，ＲＯＴＴＩＥＲ　 Ｐ　 Ｊ，ｅｔ 　 ａｌ．Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ 　 ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ 　ｐ ｉ ｇｅｏｎ　ａｎｄ　ａｖｉａｎ　ｐａ－ ｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ 　ｔｙｐｅ 　１ ｖｉｒｕｓｅｓ 　ｉｎ　ｐ ｉ ｇｅｏｎｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｌｉｎｉｃａｌ 　 ｓｉ ｇｎｓ，ｖｉｒｕｓ 　 ｓｈｅｄｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ［ Ｊ］．Ａ－ ｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１１，４０（ ２）：１２５ －１３０．

［ ５］　ＣＯＬＬＩＮＳ　 Ｍ　 Ｓ，ＳＴＲＯＮＧ　 Ｉ，ＡＬＥＸＡＮＤＥＲ　 Ｄ　 Ｊ，ｅｔ 　 ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔ ｙ　ａｎｄ　 ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ 　 ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ 　 ｔｈｅ　ｖａｒｉ－ ａｎｔ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ 　 ｔｅｒｍｅｄ“ ｐ ｉ ｇｅｏｎ　ＰＭＶ－１”ｖｉｒｕｓｅｓｂａｓｅｄ　ｏｎ 　 ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　 ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ 　 ｔｈｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　 ｐ ｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ［ Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，１９９６，１４１：６３５ －６４７．

［ ６］　ＴＯＹＯＤＡ　Ｔ，ＳＡＫＡＧＵＣＨＩ　Ｔ，ＨＩＲＯＴＡ　Ｈ，ｅｔ 　ａｌ．Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ 　 ｅｖｏｌｕｔｉｏｎⅡ．Ｌａｃｋ　ｏｆ 　 ｇｅｎｅ 　 ｒｅ

－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ 　 ｉｎ　 ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ 　 ａｎｄ　ａｖｉｒｕｌｅｎｔ 　 ｓｔｒａｉｎｓ ［ Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８９，１６９：２７３ －２８２．

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ｎｏｔ 　 ａｌｗａｙ ｓ 　 ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ 　 ｔｈｅ 　 ｃｌｅａｖａｂｉｌｉｔ ｙ　ｏｆ 　 ｉｔｓ 　 ｆｕ－ ｓｉｏｎ　 ｐ ｒｏｔｅｉｎ［ Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，２００９，９０（１１）：２７４６－２７５０．

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［ １３］　ＤＯＲＴＭＡＮＳ　 Ｊ　 Ｃ，ＲＯＴＴＩＥＲ　 Ｐ　 Ｊ，ＫＯＣＨ　Ｇ，ｅｔ 　 ａｌ． Ｐａｓｓａｇｉｎｇ　ｏｆ 　 ａ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　 ｐ ｉ ｇｅｏｎ　ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ 　 ｒｅｓｕｌｔｓ 　 ｉｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　 ｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｍｕｔａ

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